口腔粘膜白斑研究概况

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白斑(oral leukoplakia, OLK)是由匈牙利皮肤科医生Erno Sohuimmer于1887年首先命名。百余年来，有关口腔粘膜白斑的研究不断深入，对该病的定义也几经反复。1996年瑞典Uppsala国际口腔白色病损会议研讨的最新定义为“发生在口腔粘膜上，不能被诊断为其他疾病，以白色损害为主的疾病，某些病例可能转化为癌”。由于口腔白斑与WHO 1972年公布的癌前病变概念相符［1］，因而被公认为口腔斑纹类疾病中最具典型性的癌前病变之一，受到学术界广泛关注。作者就口腔白斑的实验研究、基础研究和临床研究诸方面的国内外学术动态作一综述。

一、口腔白斑的动物模型研究

由于免疫组化等新技术的普及，对既往的人组织切片行回顾性研究已成可能。然而在口腔白斑的实验研究(尤其是动态观察)中，动物模型仍有不可替代的作用。长期以来，不少学者采用松节油、烟草、致癌剂等化学方法；温度刺激、局部创伤等物理方法；白念菌感染等生物学方法进行了大量探索，以求寻找和建立操作简捷、结果稳定、与人体组织相似性好的动物模型。

1. 9、10-二甲基苯丙蒽(dimethylbenzanthracene, DMBA)诱导的金地鼠颊囊粘膜白斑是迄今最经典的模型。1954年Salley［2］首次诱导成功后，半个多世纪中对DMBA诱导方法的标准化、病理学变化特征及其规律，上皮异常增生与癌变关系，以及与人粘膜上皮异常增生特征比较等方面的研究，使该模型日臻完善。近年来通过增殖细胞核抗原(PCNA)、5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)等免疫组化检测和电镜等形态学综合观察，发现该模型在“正常上皮→异常增生(轻度→中度→重度)→原位癌”的清晰时间变化序列中，PCNA的阳性细胞率有动态上升趋势；电镜反映细胞内线粒体增多、核仁增大、核分裂象增多、基底细胞伪足样突起也随上皮细胞异常增生程度加重而加剧。说明该模型显示的“白斑癌变”具有细胞动力学基础［3］。

2.4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquino-line-1-oxide, 4NQO)饮水诱发大鼠舌粘膜白斑是近年研究较多的模型［4］。我院一项研究中用0.002% 4NQO水溶液喂养SD大鼠，作舌背粘膜组织学观察。9周时，轻中度上皮异常增生占20%；13周时，上皮异常增生为100%(其中轻、中度66.6%，重度33.3%)；16周时，有44.4%出现原位癌。肉眼观察该模型9周后有粘膜白斑出现。由于该模型避免了金黄地鼠颊囊与人口腔解剖结构差别较大的缺陷，诱癌操作方法比金黄地鼠颊囊涂擦法简便，加上舌背部位较颊囊暴露容易观察等优点，有望成为更理想的白斑模型。

二、人类口腔白斑的细胞株研究

建立人类口腔白斑细胞株是白斑实验研究中的一种大胆设想。因为与以实验动物为材料的口腔白斑相比，前者更具有直接性和说服力。同时，以细胞株为材料的实验研究，具有条件易控，干预因素单纯等体外实验的优越性，因而成为重要的探索目标。英国学者Sidney等［5］在1992年成功地建立了一株人的发育异常的口腔角化细胞株(displastic oral keratinocyte, DOK),已传代150多代。经证实，该细胞株的病理学和生物学特性确实与白斑相同。鉴于白斑是一个临床与组织病理混合的概念，因此确切地判定白斑细胞是很困难的。所以具有口腔白斑主要病理特征的异常发育的上皮细胞株可以被认为是研究口腔白斑的合适对象。DOK在探讨烟草、病毒、槟榔等致癌因素的作用机制以及其他与白斑有关的实验研究方面可以发挥作用。

三、白斑癌变机制的研究

口腔白斑癌变机制错综复杂，虽有大量文献报道，但迄今为止仍无一家学说能够完整明了地阐述。我国自上一个十年开展全国性大面积流行病学调查以来，普遍认为白斑癌变与理化因素长期作用，致癌剂损伤，遗传物质以及免疫功能不全有关［6］。近十年来，国内外学者又从微生物学、微环境学、细胞动力学和分子生物学的不同角度和层次，对白斑癌变机制更加深入地研究，取得了一些成果。

1.白斑与念珠菌感染的密切关系早在70年代被发现。Cawson Renstrup，许国祺等分别报道白斑患者伴有念珠菌感染的比例达10.8%～35.6%［6］。现有人提出采用DNA指纹(fingerprinting)技术，对白念作出准确的遗传型鉴定不仅可能［7］，而且对进一步阐明白色念珠菌在引发白斑及其癌变中的作用机理有积极意义。

人类乳头状病毒(HPV)DNA和口腔癌前病变的关系也有阐述，发现HPV16、HPV6、HPV2 DNA与口腔白斑关系密切，部分扁平苔藓为HPV6、HPV11、PHV16、HPV18阳性［8，9］。除此之外，EBV与癌前病变或口腔癌亦有密切关系。Cruz等研究发现口腔癌中EBV的检出率为100%，在癌前损害中为77.8%，而在正常口腔粘膜中仅为8.3%。说明在口腔癌和癌前损害组织中EBV检出率明显高于正常组织，Cruz等认为与患者的免疫功能低下密切相关［10］。

2.微环境因素是肿瘤发生学中越来越受到重视的领域之一。由癌前病变渐变为癌及肿瘤形成后的发展、转移过程中，血管生成(angiogenesis)起着关键作用。Folkman等［11］在转基因鼠胰岛由正常→异常增生→肿瘤的多阶段过程中发现，肿瘤发生早期即有新生血管形成，李龙江，温玉明［12］对DMBA诱发的金地鼠颊囊癌变过程的动态观察也发现相同结果。我院近年来在“金黄地鼠颊囊癌演变过程中血管生成的观察研究”实验中，采用树脂血管铸型、墨汁血管灌注、图像分析和α平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)［13］免疫组化测定等多种方法联合观察，结果发现在涂DMBA 5～7周和8～9周时，即白斑生成和白斑癌变期间，血管密度和血管面积密度值持续上升，显示了旺盛的血管生成活性。而α-SMA则随接触致癌剂时间的延长和病变由轻、中、重度异常增生演变为癌呈渐进性递减，提示白斑癌变过程中不仅有血管数量和空间构形的变化，而且有血管肌上皮细胞分化差等质的变化。

3.细胞动力学是肿瘤发生机理研究中引人注目的另一领域。细胞周期包括G1、S、G2、M、G0等期，正常的细胞增殖和分化受到生理机制调节。研究发现，增殖失控、分化受阻是肿瘤细胞区别于正常细胞的基本特征。周曾同等近年对金黄地鼠颊囊癌前病变细胞动力学的研究［7］中，采用抗增殖细胞核抗原(PCNA)和5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)测定，发现此两项能敏感反映细胞增殖周期中DNA合成活跃程度的免疫组化指标，与光镜观察的粘膜上皮由正常→各级异常增生→原位癌变动趋势呈正相关，并与肉眼观察的粘膜白斑癌变过程吻合，反映出白斑癌变过程的细胞异常增殖本质。此外还有人以LSAB法，用细胞周期素(cyclin D1)等多克隆抗体作80例石蜡标本的回顾性免疫组化测定，发现正常或单纯增生组织中cyclin D1阳性率低下，随异常增生的加重阳性率上升可达40%，至浸润癌达50%。

4.分子生物学大量研究证实，肿瘤是基因的疾病。白斑癌变概莫能外。虽然目前分子生物学技术在白斑癌变机理的研究中尚处于起步阶段，所得结果还远不能完整系统地阐明分子机理，但它毕竟为更深层次揭示白斑癌变的本质提供了有力手段。随着聚合酶链反应(PCR)、原位杂交(ISH)等技术的广泛应用和免疫组化方法的不断改进，已经发现与白斑癌变有关的癌基因和抑癌基因包括Ha-ras、c-myc、bcl-2、C-erbB-1、nm23、Rb等。p53、p16、p21、K10、K13等基因表达产物和基底膜蛋白(LN、FN等)以及表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)及其受体fLK-1、转化生长因子β1(TGF-β1)等多种细胞因子，均发现与白斑癌变有关。例如，有研究发现EGFR及其调节基因C-erbB-1在单纯增生的上皮中EGFR中度表达；在异常增生的上皮中高度表达，可见C-erbB-1基因和EGFR在口腔粘膜恶变过程中发挥潜在作用。又如，近二三年来，染色体杂合性的丧失(loss of heterozygosity, LOH)与口腔癌及癌前病变发生和发展的关系受到了密切关注。研究发现在正常口腔粘膜中，不存在LOH或等位基因的不平衡；在良性增生组织中LOH高频率见于9p21、3p21、17p31；在口腔癌前病变中LOH高频率见于Tp53、DCC、3p21.3～22.1、3p12.1～13、3p13～21.1、3p21.3～25、3p25；在口腔癌中LOH高频率见于3P、8pter-21.1、9P、11q、13q、17p21。上述结果提示遗传畸变或等位基因不平衡是口腔癌前病变和口腔癌发生的早期事件，它们的发生是由于LOH中含有癌基因或抑癌基因。

5.细胞凋亡理论和端粒酶检测使白斑癌变的分子机理研究更深一步。细胞凋亡(apoptosis)也称为程序性细胞死亡(programmed cell death)，是细胞衰老死亡过程的主要形式，也是体内细胞的生理性调节过程。倘若某些基因发生变异，则可能导致细胞凋亡受阻，从而导致肿瘤或癌前病变的发生。野生型p53基因是一个重要的抑癌基因，它可引起细胞的程序性死亡，对维持组织平衡及正常细胞的发展具有重要意义。假使p53基因发生突变，则可使细胞发生无限增殖，从而导致肿瘤及癌前病变的发生。Nishioda等研究发现在口腔粘膜白斑中，10%(2/20)显现与p53抑癌基因的突变相关［9］，而p53抑癌基因的突变直接影响细胞的凋亡过程，从而导致细胞的增殖和口腔粘膜白斑的发生。影响细胞凋亡的常见癌基因还有c-myc、bcl-2和Bax。其中，c-myc具有双向作用，它既可促进凋亡，亦可抑制凋亡，其作用视功能状况而定。bcl-2抑制细胞凋亡，而Bax是重要的促进细胞凋亡的基因。有研究发现，在白斑癌变过程中，随细胞恶性程度增高，Bax的蛋白表达呈递减趋势。端粒是真核生物线性染色体末端一种特殊的异质结构，端粒DNA决定了细胞的寿命，并与细胞的自然凋亡与癌变密切相关。而端粒长度的持续需要端粒酶的激活，所以端粒酶的活力对于永生细胞的无限增殖能力是必须的。研究证实大部分肿瘤细胞都呈端粒酶阳性，部分口腔白斑(38%)也呈端粒酶阳性，而正常人体组织均无表达。提示端粒酶活性及端粒功能状态与白斑癌变密切相关［14］。