免疫印迹技术

• 检查部位：其他
• 科室：体检保健科
• 空腹检查：否
• 禁忌人群：
• 参考价格：

免疫印迹技术——检查细节、注意事项、步骤、结果解读

免疫印迹技术——检查项目的不适宜人群：

免疫印迹技术——检查项目的注意细节：

不适宜人群：无

检查时禁忌：无

检查时禁忌：

1.一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。

2.显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。

3.DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。

免疫印迹技术——检查项目的一般步骤：

(一)蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13，000g离心15min。取上清液作为样品。

(二)电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

(三)转移：(半干式转移)

1.电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

2.膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。

3.转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源，恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

(四)免疫反应：

1.用0.01MPBS洗膜，5min×3次。

2.加入包被液，平稳摇动，室温2hr。

3.弃包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。

4.加入一抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4℃放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

5.弃一抗和1%BSA，用0.01MPBS分别洗膜，5min×4次。

6.加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释)，平稳摇动，室温2hr。

7.弃二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。

8.加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

免疫印迹技术——检查项目结果解读：

(一)蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13，000g离心15min。取上清液作为样品。

(二)电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

(三)转移：(半干式转移)

1.电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

2.膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。

3.转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源，恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

(四)免疫反应：

1.用0.01MPBS洗膜，5min×3次。

2.加入包被液，平稳摇动，室温2hr。

3.弃包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。

4.加入一抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4℃放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

5.弃一抗和1%BSA，用0.01MPBS分别洗膜，5min×4次。

6.加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释)，平稳摇动，室温2hr。

7.弃二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。

8.加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。